Em 1993, Kary Mullis, um geneticista ao serviço da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da Califórnia, recebeu o prémio Nobel da Química pelo desenvolvimento de um método que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Esta técnica faz parte integrante da moderna biotecnologia molecular, tendo trazido um enorme progresso a áreas como o diagnóstico de doenças, medicina forense entre muitas outras para além da Investigação em Biologia.
A técnica de PCR (polymerase chain reaction - reação em cadeia pela polimerase) baseia-se no processo de replicação de DNA que ocorre in vivo
Para realizar PCR são necessárias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampão salino contendo a polimerase, oligonucleótidos iniciadores, os quatro desoxinucleótidos constituintes do DNA e o cofactor Mg2+. Esta mistura é submetida a vários ciclos de amplificação que consistem em:
Desnaturação do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96ºC), de modo a separar as duas cadeias
Associação dos iniciadores por ligações de hidrogênio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associação, a mistura de reacção é arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65ºC, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequência a amplificar)
Extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72ºC)
O processo envolvendo estes três passos, pode ser repetido várias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possível aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentração de DNA pré-existente.
Guanina -Timina - Citosina e Adenina (GTCA) são bases nitrogenadas encontradas no DNA todas com exceção da Timina(T) são encontradas no RNA, onde (T) é substituído por Uracila(U). Quando o DNA está em dupla hélice, as bases estão na forma mais estável quando emparelhadas com a sua base complementar: Adenina (A) com Timina (T) ou Uracila (U), e Citosina (C) com Guanina (G). Sendo que no DNA só aparecem as bases ATGC, onde A pareia com T através de duas ligações de Hidrogênio e G pareia com C através de três ligações de Hidrogênio, isso é chamada regra de Chargaff. A base Uracila só parece no RNA.
A técnica de PCR (polymerase chain reaction - reação em cadeia pela polimerase) baseia-se no processo de replicação de DNA que ocorre in vivo
Para realizar PCR são necessárias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampão salino contendo a polimerase, oligonucleótidos iniciadores, os quatro desoxinucleótidos constituintes do DNA e o cofactor Mg2+. Esta mistura é submetida a vários ciclos de amplificação que consistem em:
Desnaturação do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96ºC), de modo a separar as duas cadeias
Associação dos iniciadores por ligações de hidrogênio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associação, a mistura de reacção é arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65ºC, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequência a amplificar)
Extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72ºC)
O processo envolvendo estes três passos, pode ser repetido várias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possível aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentração de DNA pré-existente.
Guanina -Timina - Citosina e Adenina (GTCA) são bases nitrogenadas encontradas no DNA todas com exceção da Timina(T) são encontradas no RNA, onde (T) é substituído por Uracila(U). Quando o DNA está em dupla hélice, as bases estão na forma mais estável quando emparelhadas com a sua base complementar: Adenina (A) com Timina (T) ou Uracila (U), e Citosina (C) com Guanina (G). Sendo que no DNA só aparecem as bases ATGC, onde A pareia com T através de duas ligações de Hidrogênio e G pareia com C através de três ligações de Hidrogênio, isso é chamada regra de Chargaff. A base Uracila só parece no RNA.
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